遗传密码除了ATCG四碱基之外，其中胞嘧啶C也因其嘧啶环第5位碳原子的甲基化修饰，携带表观遗传信息而被称为第5位碱基（5-甲基胞嘧啶，5mC）。DNA的甲基化修饰自1948年被发现以来，一直都是表观遗传领域的研究热点[1]。DNA的甲基化修饰赋予了DNA双链除蛋白质编码信息外的表观遗传记忆，对基因组稳定性、基因表达和发育具有深远的影响[2]。随着DNA的去甲基化酶--DNA双加氧酶TET的发现，胞嘧啶甲基化修饰的氧化形式才渐渐进行人们的视野[3, 4]。5羟甲基化胞嘧啶是甲基化胞嘧啶最常见的氧化形式，不单单是5mC主动去甲基化的中间体，而且是基因组中稳定存在的修饰形式，有着特异的结合蛋白，在调控胚胎发育、干细胞分化、神经系统的塑造及在肿瘤等复杂疾病中具有重要作用[2, 5]。
// 5hmC的分析技术
用以区分胞嘧啶与5mC及其氧化产物的方法很多，大体上可以分为基于物理（HPLC、质谱等），化学（亚硫酸氢盐、高钌酸钾等）以及生物（限制性内切酶、TET酶、APOBEC酶、5hmC抗体、MBD蛋白等）三种原理。然而胞嘧啶的不同修饰形式在分子结构上具备相似性，所以我们常用的化学或生物的方法并不能很好的区分5mC及其氧化衍生物。例如常用的亚硫酸氢钠（BS）法就不能区分5mC与5hmC，平常BS方法得到的所谓5mC其实是5mC与5hmC的集合。
图 1. 胞嘧啶及其不同修饰衍生物的分子结构。
胞嘧啶修饰的分析技术是从5mC开始的，自5hmC于2009年被发现后多种技术被开发以检测5hmC水平，这些技术主要是基于亲合层析的原理，并不能在单碱基水平分析5hmC的修饰情况(图 2)。随后于2012年在Cell与Nature发表的两篇文章中分别报道了TAB-seq与oxBS-seq技术，达到了单碱基分辨基因组中的5hmC的水平，这两种技术的关键是5hmC的氧化，分别采用TET酶或高钌酸钾氧化原理[6, 7]。其后随着5fC的发现也开发了5fC的检测技术(图 2)。
图 2. a, 胞嘧啶修饰的技术技术发展史。b, TAB-seq原理示意图。c, oxBS-seq原理示意图。
对于5mC以及其氧化产物的区分技术手段多样，而且受到各种修饰形式的化学结构的特点的影响，目前已经开发了的甲基化修饰研究技术种类繁多，让刚刚接触的研究人员难以抉择。以下有几张经典的总结示意图帮助大家理解。
如图 3所示，对于5mC及其氧化形式的检测最常用的方法有两种：基于BS的化学修饰法，以及基于亲和层析的富集法，各自的代表性技术以及能够检测的碱基修饰各不相同，所以例如oxBS-seq方法要分析5hmC，需要用BS-seq方法得到的结果减掉oxBS-seq的结果。
图 3. 5mC及其氧化物的分析原理示意图。（基于BS的化学修饰法与基于亲和层析富集法）
多年来，众多科学家们前赴后继开发了多种DNA 修饰的检测和定量技术，这些技术将化学修饰方法或酶促反应灵活地与芯片或测序相结合，使得我们能够更经济快捷地研究表观遗传变异与表型之间的关联。对甲基化修饰分析技术感兴趣的话，可以参考图 4，其中更全面地总结了不同技术手段相组合而得到的各种胞嘧啶修饰分析技术。
图 4. DNA甲基化修饰分析技术原理汇总。
// 中科普瑞推出『高通量5hmC甲基化标志物筛选新技术』
对于5hmC的研究要考虑到成本、分析时间与准确度等关键因素。虽然测序技术能够提供很多序列特征的信息，但当测序深度较低时则难以得到准确的甲基化定量结果。而甲基化芯片是成熟的甲基化研究工具，因其稳定而准确的结果，被广泛应用于肿瘤、老年性疾病等复杂疾病的研究中。特别是对数据结果的可靠性有着严格要求的表观基因组关联研究，Illumina的850K芯片是首选平台。然而850K芯片依赖于传统亚硫酸氢盐（BS）方案，不能区分5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。中科普瑞此次推出了基于Illumina850K甲基化芯片检测的高通量5hmC检测新方法，以特异性稳定可靠检测全基因组中85万个胞嘧啶的5hmC修饰。技术原理如图5所示。
图 5. 利用Illumina甲基化芯片进行5hmC检测技术路线。
该技术基于甲基化芯片可靠的技术平台，能够稳定可靠地在全基因组水平上检测5hmC修饰情况。如图6，图7所示借助该技术，可以对基因组中的5hmC修饰进行检测，可达到较高的重复性。
图 6. 技术质控结果。a, 基于亚硫酸盐转化的技术重复散点图。b. 对5hmC进行芯片检测新方法的技术重复散点图。
图 7.染色体区段展示5hmC技术重复结果。
我们同时利用该技术检测了一对肿瘤样本，并与其BS检测结果进行对比，验证在肿瘤中普遍地低5hmC现象。
图 8. 肿瘤中的5hmC差异染色体分布图，在肿瘤中的5hmC整体低于癌旁。
从染色体分布结果可见5hmC在基因的启动子区以及CpG岛结构的低甲基化修饰水平。
图 9. 同一对肿瘤与癌旁样本中的BS结果以及5hmC结果染色体展示。由上往下依次为Ca_BS, N_BS, Ca_5hmC, N_5hmC, CpG岛注释与转录本注释。
中科普瑞此次推出高通量5hmC检测新方法，拥有高效、简便、准确的技术特色，再结合成熟而稳定的IIumina 850K甲基化芯片平台，将完美解决5hmC标志物筛选的技术痛点，实现5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的并行高通量检测。欢迎广大科研工作者来电或在线咨询5hmc检测合作服务事宜！
